該研究有*意義，是有史以來篇用步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk）來評價骨重建中疼痛緩解，并用局部麻醉鎮(zhèn)痛的文章。文章來源于The Journal of Pain（2017年影響因子4.859），2018年5月15日發(fā)表，本文將為大家做詳細(xì)闡述。
有文獻(xiàn)報道這種疼痛是自體骨移植術(shù)后的主要并發(fā)癥之一 , 可能危及手術(shù)全程的成功，這種疼痛必須在術(shù)后3-4天內(nèi)得到控制和減少，以防止它變成慢性的。術(shù)后前四周的疼痛護(hù)理會更地降低其轉(zhuǎn)化成慢性疼痛的風(fēng)險。
傳統(tǒng)治療會給予系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛劑，比如對乙酰氨基酚，非甾體抗炎藥和含嗎啡的藥品，這些傳統(tǒng)的對身體的損副作用和傷害大，同時鎮(zhèn)痛劑處方會增加總體花費(fèi)。磷酸鈣（CaP）骨替代物和CaP骨水泥（CPC）現(xiàn)在被認(rèn)為是許多骨填充骨科手術(shù)適應(yīng)癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。
它們可以被細(xì)胞吸收，具有明顯的骨傳導(dǎo)特性，作為局部藥物傳遞系統(tǒng)，可以與生物活性分子和治療劑結(jié)合。由于CPCs已成為許多骨科及外傷適應(yīng)癥的治療方法，因此作者設(shè)計了一種新型的生物注射材料，將CPC與不同的局部麻醉藥粘合在一起，用于骨科或骨外傷適應(yīng)癥。
作者目的是1）通過步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk）對骨填充手術(shù)術(shù)后疼痛進(jìn)行功能評價；2）評價骨損傷填充手術(shù)結(jié)合使用的磷酸鈣水泥對于術(shù)后疼痛的緩解；3）評估他們的機(jī)械和生物學(xué)性能。具體方法是利用手術(shù)在大鼠股骨遠(yuǎn)端制造了一個臨界大小的骨缺損模型，并在其損傷處以裝載或不裝載帶局部麻醉劑的注射用磷酸鈣骨水泥（CPC）為填充來緩解骨重建修復(fù)術(shù)后的疼痛。
通過使用步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk）所測量的步態(tài)的變化來對比不同的CPC裝載材料對于CPC骨重建修復(fù)手術(shù)后創(chuàng)傷疼痛的緩解。結(jié)果表明，術(shù)后短期時間內(nèi)，在腳印面積和腳印平均接觸強(qiáng)度這兩個指標(biāo)上兩種鎮(zhèn)痛方法都有顯著的疼痛緩解。與術(shù)前的基礎(chǔ)值相比，CPC組，裝載羅哌卡因CPC組(CPC-Ropi)，和裝載丁哌卡因CPC組 (CPC-Bupi)在第24小時，腳印面積值分別降低了65%, 42%和24%，同時腳印平均接觸強(qiáng)度也分別降低了25%, 9%和1%。CPC-Bupi比CPC-Ropi有更的功能康復(fù)效果。
除此之外，CPC手術(shù)保持了機(jī)械和生物學(xué)性能。這步態(tài)結(jié)果可能乍一看有點(diǎn)不思其解，這三個組都比對照組降低了啊，怎么說明哪個比哪個好呢？ 這個結(jié)果側(cè)面說明了疼痛程度，對照組的肯定高，這三個手術(shù)組的老鼠疼啊，所以腳爪接觸面積和接觸強(qiáng)度肯定是都降低的，哪個方法效果更佳，肯定是降低的數(shù)值更少的那個了。
在過去的十年里，步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk）已經(jīng)被證明是一種無創(chuàng)的評估慢性疼痛的方法，被證實(shí)為研究嚙齒類動物許多疾病模型的方法工具，如神經(jīng)退行性疾病，肌筋膜炎癥，周圍神經(jīng)損傷，骨關(guān)節(jié)炎，外傷。該方法通過視頻跟蹤分析步態(tài)，對每個爪印的時空參數(shù)和動態(tài)肢體協(xié)調(diào)進(jìn)行了完整的分析。
上圖所示，大鼠術(shù)后步態(tài)分析采用步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk）具體參考之前文獻(xiàn)報道，總的來說CatWalk的原理是：大鼠在一條8厘米寬的走廊里，非強(qiáng)迫自主穿過一塊發(fā)光的玻璃板，與玻璃板接觸后，腳爪把綠燈反射到下面的攝像機(jī)（100HZ）上，攝像機(jī)就會記錄整個運(yùn)動的過程。每只動物的每一次實(shí)驗的步態(tài)相關(guān)指標(biāo)都會被系統(tǒng)記錄，整個過程沒有食物誘導(dǎo)刺激。
手術(shù)過程見下圖：
圖1，骨水泥手術(shù)過程
A）手術(shù)一個圓柱狀尺寸合適的切口；（B）填充注射骨水泥修復(fù)；（C）在縫合之前填充切口
實(shí)驗分組：3個CPC實(shí)驗組，其實(shí)還有1個隱藏組（Control）：手術(shù)前后的自身對比
1. Control group (preoperation的Control組)
2. CPC unloaded with anesthetic agent (CPC組)
3. CPC loaded with 8% bupivacaine (CPC-Bupi組)
4. CPC loaded with 8% ropivacaine (CPC-Ropi組)
實(shí)驗protocol：手術(shù)前兩周，每天讓大鼠適應(yīng)走廊環(huán)境在其中自由活動，手術(shù)前一天的適應(yīng)訓(xùn)練的數(shù)據(jù)作為術(shù)前參考值。為了排除個體差異性，用每一只自身手術(shù)前后的值來對比統(tǒng)計。分別在手術(shù)后第2,4,6,24,48,72小時,以及第7天第14天測CatWalk數(shù)據(jù)。步態(tài)分析實(shí)驗對清楚磷酸鈣水泥的相同實(shí)驗員設(shè)盲，開始操作注射水泥的時間記為第0天。
下來是實(shí)驗裝置和具體統(tǒng)計的數(shù)據(jù)：步態(tài)分析系統(tǒng)的走廊長42cm，符合標(biāo)準(zhǔn)的步態(tài)會被記錄：1）通過走廊全程的時間在1-5秒之間；2）速度大變化不超過80%，標(biāo)準(zhǔn)之外的數(shù)據(jù)系統(tǒng)不會去采集記錄（圖2A）。統(tǒng)計以下數(shù)據(jù)：
1、腳印面積 (cm2) 是在站立時相完整腳印的表面積（圖2B）。
2、腳印平均接觸強(qiáng)度（AU）：完整腳印在一個步長周期中步態(tài)支撐期接觸的平均強(qiáng)度（圖2C）。
3、腳印長度（cm）：第三指中間到腳后跟的距離（圖2C）。
4、支撐期比重（%）：在一個步長周期中，支撐期所占比重（圖2D）。
這四個指標(biāo)都是經(jīng)典的用來衡量疼痛與康復(fù)的數(shù)據(jù)，其中腳印平均接觸強(qiáng)度被報過用來評估神經(jīng)性疼痛，包括機(jī)械性痛覺超敏。
圖2， 健康大鼠的步態(tài)分析效果圖
（A）對照組大鼠在CatWalk系統(tǒng)上的背景圖；（B）術(shù)前的CatWalk腳?。_印面積）左腳印紅色，右腳印藍(lán)色，后肢顯示淺色，前肢深色；（C）一個正常大鼠的右后腿爪，顯示出的手動腳印測量長度和腳印接觸強(qiáng)度；（D）術(shù)前CatWalk步態(tài)圖
除了做步態(tài)分析外，作者還做了掃描電鏡和組織學(xué)實(shí)驗，更進(jìn)一步驗證自己的實(shí)驗。在Leo 1450VP掃描電鏡圖像下，手動標(biāo)記興趣區(qū)（活性區(qū)域）包括新形成的骨和水泥吸收的表面部分，這個在后面具體的電鏡數(shù)據(jù)上來直觀地觀察這三個部分的變化。
圖3，股骨植入后的掃描電鏡圖像
使用Leica QWin Pro軟件來分析興趣區(qū)，具體是：（A）生物活性區(qū)（淺藍(lán)色區(qū)域），它包括了（B）新形成的骨頭（綠色區(qū)域）和（C）骨水泥吸收的表面（藍(lán)色區(qū)域）。
接下來就是數(shù)據(jù)結(jié)果分析了，首先是CatWalk的結(jié)果分析：手術(shù)前，動物步態(tài)正常，與對側(cè)相比，右后腿爪的印紋面積和印紋長度沒有顯著差異。術(shù)前基礎(chǔ)參考的平均值為：腳印面面積1.88±0.03 cm2，腳印平均接觸強(qiáng)度115.28±0.55 AU，腳印長度1.86±0.02cm2，支撐期比重66.34%±0.56%。
圖和6A顯示的是手術(shù)前后腳印面積的變化。CPC組腳印面積從2.04±0.07 cm2手術(shù)前的值下降到24小時之后的0.66±0.06 cm2，14天以后逐漸增加到1.60±0.06 cm2。在這兩種骨水泥中，在術(shù)后次減少后，與未加載的CPC在14天時相比，兩種均可以更快地恢復(fù)到基線值。
術(shù)后24小時，骨水泥處理大鼠的步態(tài)變化達(dá)到高水平（從基礎(chǔ)值降到低），這說明了CPC-Bupi和CPC-Ropi組的相比CPC組腳印面積有了顯著增加（P＜0.01）：CPC-Bupi組1.44±0.06 cm2，CPC-Ropi組1.10±0.06 cm2，圖5B中腳印圖也可以很直觀的對應(yīng)此結(jié)果。與此同時，兩種水泥之間也是有差異的，CPC-Bupi組腳印面積明顯大。術(shù)后48小時后，兩種水泥跟CPC相比，依然有差異，一直持續(xù)到第7天，CPC-Bupi組恢復(fù)到手術(shù)前的基礎(chǔ)值時才消失。
圖5，實(shí)驗組術(shù)后右后爪的腳印面積
(A) CPC組表示為黃色實(shí)線，CPC-Bupi組藍(lán)色點(diǎn)虛線，PC-Ropi組綠色點(diǎn)劃線，手術(shù)前的參考組黑色虛線。用雙因素方差分析，事后分析Fisher檢驗，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(N = 6),* P < 0.01 (CPC-Bupi vs CPC-Ropi vs CPC),** P < 0.01 anesthetic loaded-CPCs vs CPC, # P < 0.01 CPC-Bupi vs others；（B）手術(shù)后24小時每組腳印面積圖
接觸強(qiáng)度的結(jié)果也是這樣（圖6B）。術(shù)后24小時，與術(shù)前基礎(chǔ)值相比，CPC組，CPC-Bupi和CPC-Ropi組分別下降了25%±2%，9%±2%，1%±2%。這三組互相比較都有顯著差異（P＜0.01），48小時后，CPC組下降至低（79%±2%），分別與CPC-Ropi組（96%±2%）和CPC-Bupi組（98%±2%）比較。有趣的是，CPC-Ropi組全程跟術(shù)前的基礎(chǔ)值相比都沒有統(tǒng)計差異，這一點(diǎn)很費(fèi)解。術(shù)后第14天，CPC組和CPC-Bupi組開始回到基礎(chǔ)值，這種差異才消失。
與腳印面積結(jié)果一致，腳印長度在術(shù)后是降低的（圖6C）。24小時后，CPC組腳印長度的值為72%±2%，CPC-Bupi組和CPC-Ropi組分別為91±2%，88±2%，與CPC組相比這兩組都有統(tǒng)計差異（P＜0.01），但是CPC-Bupi組和CPC-Ropi組本身沒差異。7天后，這兩組與術(shù)前基礎(chǔ)值相比也沒差異了。
圖6，三種骨水泥的4種測試參數(shù)
（A）術(shù)前腳印面積的基礎(chǔ)值；（B）術(shù)前腳印接觸強(qiáng)度的基礎(chǔ)值；（C）腳印長度占術(shù)前的百分比重；（D）支撐期比重占術(shù)前的基礎(chǔ)值百分比；CPC組表示為黃色實(shí)線，CPC-Bupi組藍(lán)色點(diǎn)虛線，PC-Ropi組綠色點(diǎn)劃線，手術(shù)前的參考組黑色虛線。用雙因素方差分析，事后分析Fisher檢驗，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(N = 6), * P < 0.01 (CPC-Bupi vs CPC-Ropi vs CPC), ** P < 0.01 loaded-CPCs vs CPC, # P < 0.01 CPC-Bupi vs others
支撐期比重在整個手術(shù)過程中都沒有表現(xiàn)出來差異，這兩種水泥組也沒有差異。相反，在24小時后，CPC組支撐起比重值降低并且和兩種水泥組相比有顯著差異（P＜0.01）：CPC組84%±2%，CPC-Ropi組95%±2%和CPC-Bupi組99%±2%。術(shù)后48小時開始差異消失，第7天恢復(fù)至術(shù)前的值。
結(jié)果除了步態(tài)分析，還有SEM（掃描電鏡）和組織學(xué)結(jié)果分析，可見作者實(shí)驗設(shè)計的嚴(yán)格和縝密，手術(shù)3周后，注射植入的骨水泥仍然在注射的位置可見，同時新生的骨質(zhì)層相同位置也能觀察到骨水泥 (圖7A)。
不僅如此，所有骨水泥均觀察到骨樣組織與成骨細(xì)胞細(xì)胞系交界，這說明使用三種不同的骨水泥，不影響新生骨質(zhì)的生長。在所有的骨水泥（與骨組織之間），可以看到骨組織被一條由成骨細(xì)胞排成的線標(biāo)記出邊沿，這說明不同骨水泥中的藥物的釋放，并沒有改變骨質(zhì)-骨水泥界面和骨修復(fù)。
上圖7為 （A）手術(shù)后的掃描電鏡圖像；（B）結(jié)果表示為新骨形成相比于興趣區(qū)的百分率
圖8術(shù)后3周后股骨標(biāo)本的組織學(xué)分析。（A）Movat染色法觀察全水泥置入后的效果（藍(lán)色=水泥；黃色-綠色=骨，淡粉色=軟組織）；（B）Movat染色下的新骨形成的詳細(xì)圖像（紅線=骨樣組織，紫線=成骨細(xì)胞細(xì)胞株）；（C）蘇木素-伊紅染色觀察骨髓
步態(tài)和掃描電鏡做完了，作者還不放心，又做了組織學(xué)的實(shí)驗，組織學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)任何不良炎癥反應(yīng)，(圖8)。圖8A 顯示的是在植入骨水泥手術(shù)后整個Movat’s染色的圖（藍(lán)色=水泥；黃色-綠色=骨，淡粉色=軟組織） Movat染色法能在一張組織切片上確定多種結(jié)締組織成分，能有效的區(qū)分軟骨的鈣化，能明顯的區(qū)分成骨細(xì)胞破骨細(xì)胞和其他成分，在研究骨的生長和修復(fù)中起關(guān)鍵作用。還有更細(xì)節(jié)的地方，染色圖里的新骨形成圖8B（紅線=骨樣組織，紫線=成骨細(xì)胞細(xì)胞株），與未加載的CPC相比，藥物的局部釋放并沒有改變加載CPCs的骨水泥界面和骨結(jié)合，后再來個蘇木素-伊紅染色看看骨髓的情況。
作者很嚴(yán)謹(jǐn)，后提出了出于動物倫理原因，手術(shù)過程中作為麻醉動物用的鹽酸丁丙諾非是按先發(fā)鎮(zhèn)痛作用皮下注射的，半衰期比嗎啡還長（大于6小時），所以擔(dān)心這種長效麻醉作用影響CatWalk早期階段的數(shù)據(jù)，同時手術(shù)情況和CatWalk實(shí)行雙盲，也是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牧硪幻?。到這里就算做完了，得出結(jié)論：本文的意義在于開創(chuàng)了一個用來評價骨重建修復(fù)引起的疼痛的指導(dǎo)方法：CatWalk步態(tài)分析體統(tǒng)從行為上直觀直接的測試，并且用了這種CPC材料和局部麻醉劑的結(jié)合來研究骨手術(shù)術(shù)后重建疼痛的緩解，對該領(lǐng)域的研究起到指導(dǎo)和借鑒作用。
參考文獻(xiàn)：
1. Maharaj MM, Phan K, Mobbs RJ. Anterior cervicaldiscectomy and fusion (ACDF) autograft versus graft substitutes: what dopatients prefer—A clinical study. J Spine Surg 2:105-110, 2016.
2. Vrinten DH, Hamers FF. ‘CatWalk’ automated quantitativegait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparisonwith von Frey testing. Pain 102:203-209, 2003.
3. Coulthard P, Pleuvry BJ, Brewster M, et al. Gait analysisas an objective measure in a chronic pain model. J Neurosci Methods116:197-213, 2002.
4. Vandeputte C, Taymans J-M, Casteels C,et al. Automatedquantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neurosci11:1, 2010.
5. Miyagi M, Ishikawa T, Kamoda H, et al. Takahashi K, InoueG, Ohtori S: Assessment of Gait in a Rat Model of Myofascial Inflammation Usingthe CatWalk System: Spine 36:1760-4, 2011.
6. Chen Y-J, Cheng F-C, Sheu M-L, et al. Pan H-C: Detectionof subtle neurological alterations by the CatWalk XT gait analysis system. JNeuroengineering Rehabil 11:1, 2014.
7. Ferland CE, Laverty S, Beaudry F, et al. Gait analysis andpain response of two rodent models of osteoarthritis. Pharmacol Biochem Behav97:603-610, 2011.
8. Gabriel AF, Marcus MAE, Honig WMM, et al. The CatWalkmethod: A detailed analysis of behavioral changes after acute inflammatory painin the rat. J Neurosci Methods 163:9-16, 2007.
9. Hamers FPT, Lankhorst AJ, van Laar TJ, et al. AutomatedQuantitative Gait Analysis During Overground Locomotion in the Rat: ItsApplication to Spinal Cord Contusion and Transection Injuries. J Neurotrauma 18:187-201,2001.
10. Olah AJ, Simon A, Gaudy M, et al. Differential stainingof calcified tissues in plastic embedded microtome sections by a modificationof Movat's pentachrome stain. Stain Technol. 1977 Nov;52(6):331-7.
